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Méthode d’essai biologique servant à mesurer la survie de collemboles exposés à des contaminants dans le sol : chapitre 3

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Section 3

Système d’essai

3.1 Installations et appareils

Les essais doivent être réalisés dans une enceinte à atmosphère contrôlée ou une installation équivalente dans laquelle on peut commander adéquatement la température et l’éclairage (v. 4.3). L’installation d’essai devrait être bien aérée afin de protéger le personnel des émanations nocives et être isolée de toute perturbation physique ou de tout contaminant susceptible de nuire aux organismes expérimentaux. La zone de travail réservée à la préparation des sols d’essai devrait être dotée d’une hotte et être ventilée adéquatement.

Pour prévenir toute contamination, il faudrait que l’installation d’essai soit isolée de la zone d’élevage des collemboles (v. 2.3). En outre, l’installation d’essai devrait être éloignée des endroits où les échantillons sont entreposés ou préparés afin d’éviter tout risque de contamination des récipients d’essai et de leur contenu à partir de ces sources. Le système de ventilation devrait être conçu et utilisé de façon à empêcher l’air de l’installation d’essai de contaminer les enceintes d’élevage, et il devrait faire l’objet d’inspections à cet égard. L’air repris dans la zone de manipulation et d’entreposage des échantillons ou dans celle réservée au traitement ou à l’analyse des substances chimiques ne devrait pas être recirculé dans la partie du laboratoire réservée aux essais.

Tout matériau de construction susceptible d’entrer en contact avec les organismes, l’eau ou les récipients d’essai à l’intérieur de l’installation d’essai doit être non toxique (v. 2.3.2) et devrait réduire au minimum la sorption de substances chimiques. On devrait utiliser, dans toute la mesure du possible, le verre borosilicaté, le nylon, le polyéthylène ou le polystyrène haute densité, les polycarbonates, les plastiques fluorocarbonés, le TéflonMC, le NalgèneMC, la porcelaine, la fibre de verre et l’acier inoxydable 316 pour réduire au minimum la sorption et le lessivage des substances chimiques. On doit éviter les matériaux toxiques, dont le cuivre, le zinc, le laiton, le métal galvanisé, le plomb et le caoutchouc naturel.

L’installation d’essai doit comporter les instruments de base exigés pour surveiller la qualité (p. ex., température, pH) du sol d’essai et de l’eau d’essai (d’hydratation) qui y est associée. En outre, le laboratoire devrait être équipé d’instruments permettant de procéder à des analyses rapides et précises de la teneur en humidité des sols d’essai. Le matériel requis comprend un four de séchage qui peut être réglé à 105 °C pour sécher les sols, une balance précise à 0,1 mg près et un pH-mètre. Le matériel de protection comprend un respirateur avec filtre contre la poussière, des gants, des vêtements de laboratoire et des lunettes de protection, et il doit être porté lorsqu’on prépare les mélanges et les aliquotes de sol d’essai.

Tous les récipients d’essai, tout l’équipement et toutes les fournitures susceptibles d’entrer en contact avec les sols de site, les sols d’essai, l’eau d’essai (d’hydratation), les solutions mères ou les solutions d’essai doivent être propres et rincés avant usage à l’eau désionisée ou distillée (c.-à-d. l’eau d’essai). On devrait laver après usage toutes les fournitures non jetables. On recommande la méthode de nettoyage suivante (EC, 1997a, 1997b, 2001, 2004a, 2005a)Notes de bas de page24 :

  1. trempage dans l’eau du robinet (avec ou sans détergent) pendant 15 min, puis récurage avec un détergent ou lavage au lave-vaisselle automatique;
  2. double rinçage à l’eau du robinet;
  3. rinçage soigneux à l’acide nitrique (HNO3) ou chlorhydrique (HCl) (qualité sans métal) frais dilué (10 % en volumeNotes de bas de page25) afin d’éliminer le tartre, les métaux et les bases;
  4. double rinçage à l’eau désionisée (ou autre eau d’essai);
  5. rinçage unique à l’acétone non diluée de qualité pesticide afin d’éliminer les composés organiques, et à l’hexane de qualité réactif (p. ex., qualité CLHP, pureté de ≥98,5 %) pour éliminer les résidus huileux (travailler sous une hotte)Notes de bas de page26;
  6. après avoir laissé le solvant organique se volatiliser des récipients sous la hotte, nouveau lavage avec du détergent (récurer au besoin);
  7. triple rinçage à l’eau désionisée (ou autre eau d’essai).

Les récipients d’essai et les appareils susceptibles d’entrer en contact avec le sol ou l’eau d’essai (d’hydratation) devraient être rincés à fond à l’eau d’essai avant d’être utilisés.

3.2 Essais initiaux et essais définitifs

3.2.1 Essais initiaux

Avant de procéder pour la première fois à des essais définitifs de toxicité d’un sol selon la méthode décrite à la section 4, le laboratoire devrait effectuer ≥5 essais de performance témoins sur un ou des échantillons du sol naturel non contaminé ou du sol artificiel qu’il utilisera (ou envisage d’utiliser) comme sol témoin négatif dans un ou des essais définitifs de toxicité d’un sol (v. 3.3). De plus, ≥5 essais avec un toxique de référence devraient être exécutés sur un ou des échantillons du sol témoin négatif artificiel ou naturel que le laboratoire entend utiliser en parallèle avec les essais définitifs (v. 4.9). Ces essais initiaux sont recommandés pour confirmer que le laboratoire peut obtenir, pour l’espèce expérimentale choisie (F. candida, O. folsomi, F. fimetaria ou P. minuta) et conformément aux conditions et procédures d’élevage décrites dans le présent document (v. 2.3), une performance acceptable dans ce sol témoin.

Les conditions et modes opératoires retenus pour exécuter ces essais initiaux sur un sol témoin négatif devraient être identiques et conformes à ceux décrits à la section 4. Dans le cas des essais initiaux avec un ou des toxiques de référence, les conditions et modes opératoires devraient être identiques et conformes à ceux décrits en 4.9. Chaque essai sur un sol témoin négatif ou avec un ou des toxiques de référence devrait être effectué avec un lot différent d’organismes expérimentaux de la même espèce provenant de la même source.

Les données des essais de performance témoins (n = ≥5) doivent montrer que les critères de validité des essais (v. 4.4) peuvent être satisfaits pour l’espèce prévue et pour le sol naturel ou artificiel qu’on entend utiliser comme sol témoin négatif dans les essais définitifs. La méthode recommandée pour mettre en parallèle les données des essais initiaux (n = ≥5) consiste à calculer et à comparer la grandeur du CV pour les séries d’essais respectives et les valeurs des paramètres (v. 4.9).

3.2.2 Essais définitifs

Les récipients d’essai qui seront utilisés dans les essais définitifs doivent être inertes aux substances d’essai et de référence ou aux mélanges de contaminants (en d’autres termes, ces substances ou mélanges ne devraient pas adhérer aux récipients d’essai ou réagir de quelque façon que ce soit avec les récipients). Les récipients devraient être assez grands pour permettre la survie et la reproduction des collemboles pendant la durée de l’essai. Il faut utiliser des bocaux en verre à col large (p. ex., bocaux Mason pour les conserves maison) d’une capacité de 100-125 mL (~5-8 cm de diamètre). Chaque bocal doit être nettoyé soigneusement avant et après emploi; on doit aussi le rincer à fond avec de l’eau désionisée ou une autre eau d’essai avant de s’en servir. Chaque récipient d’essai devrait être muni d’un couvercle en plastique ou en métal (dans ce dernier cas, un cercle vissé maintient en place le couvercle avec joint d’étanchéité en caoutchouc). Pour les essais avec P. minuta, les récipients d’essai doivent être fermés hermétiquement à l’aide d’une bande de Parafilm® maintenue en place par un cercle métallique vissé, et ce, afin d’empêcher les organismes de s’échapperNotes de bas de page27. Pendant l’essai, si la bande de Parafilm® semble endommagée ou n’adhère pas adéquatement au récipient, il faut la remplacer par une nouvelle. Il est recommandé de remplacer la bande chaque semaine afin de s’assurer qu’elle est toujours intacte et que les récipients restent fermés hermétiquement.

3.3 Sol témoin négatif

Chaque essai de toxicité d’un sol doit comporter un sol témoin négatif parmi les traitements expérimentaux. Un sol témoin négatif est essentiellement exempt de tout contaminant qui pourrait nuire à la performance des collemboles pendant l’essai. L’utilisation d’un sol témoin négatif fournit une mesure de l’acceptabilité de l’essai, une preuve de la santé et d’une performance adéquate des organismes expérimentaux, l’assurance que les conditions et modes opératoires sont appropriés et une base pour l’interprétation des données obtenues avec les sols d’essai.

Dans un essai de toxicité d’un sol, on peut utiliser un sol naturel non contaminé ou un sol artificiel comme sol témoin négatif. Les points à prendre en considération dans le choix d’un sol témoin négatif approprié comprennent le plan de l’étude, les caractéristiques physicochimiques du ou des sols d’essai et la disponibilité d’un sol naturel non contaminé présentant des propriétés acceptablesNotes de bas de page28. Pour les essais définitifs sur des échantillons de sol prélevés dans la forêt boréale ou la taïga, on devrait utiliser comme sol témoin négatif un sol naturel non contaminé. On devrait également posséder des preuves expérimentales que le sol témoin négatif choisi permettra de satisfaire aux critères de validité de l’essai établis dans le présent document en regard de chaque espèce expérimentale, et ce, de manière régulière et fiable (v. 4.4).

La première édition de la méthode d’essai biologique décrite ici a été élaborée et mise à l’essai avec cinq sols témoins négatifs présentant diverses caractéristiques physicochimiques (AquaTerra, 1998; Stephenson et coll., 1999a, 1999b, 2000a; AquaTerra et ESG, 2000; ESG, 2000, 2001, 2002; ESG et AquaTerra, 2002, 2003; Becker- van Slooten et coll., 2003, 2005; Stämpfli et coll., 2005; EC, 2007a). Ces sols non contaminés incluaient un sol artificiel et quatre sols naturels (c.-à-d. des échantillons de sols agricoles sablo-loameux et limono-loameux du sud de l’Ontario, un sol de prairie argilo- loameux de l’Alberta et un sol forestier loameux du Bouclier canadienNotes de bas de page29 dans le nord de l’Ontario). Aux fins de la présente édition, on a élargi la méthode pour y inclure des essais avec P. minuta sur des sols de la région boréale, soit huit sols naturels de cette région (podzol humo- ferrique gleyifié de Terre-Neuve, du Nouveau- Brunswick et de l’Ontario; luvisol gris foncé, brunisol eutrique orthique et brunisol dystrique éluvié de la Saskatchewan; gleysol humique régosolique et chernozem gris foncé régosolique de l’Alberta), en plus d’un sol artificiel. Ces sols présentaient des compositions différentes en ce qui a trait aux caractéristiques physicochimiques susceptibles d’influer sur le devenir et les effets des contaminants. Tous les sols prélevés sur le terrain venaient de zones n’ayant fait l’objet d’aucun épandage direct de pesticides au cours des années précédentes et, partant, étaient considérés comme « non contaminés». L’origine et les caractéristiques physicochimiques de ces sols naturels sont décrites en détail à l’annexe G. Les critères de validité des essais (v. 4.4) pour F. candida, O. folsomi, F. fimetaria et P. minuta sont fondés sur des données relatives à la performance de ces collemboles dans un sol témoin négatif, données qui ont été obtenues pour chacun des neuf sols (AquaTerra, 1998; Stephenson et coll., 1999a, 1999b, 2000a; AquaTerra et ESG, 2000; ESG, 2000, 2001, 2002; ESG et AquaTerra, 2002, 2003; Becker-van Slooten et coll., 2003, 2005; Stämpfli et coll., 2005; EC, 2007a, 2010, 2013b), notamment (Krogh, 2004).

3.3.1 Sol naturel

Le sol témoin négatif peut être un sol naturel prélevé sur un site non contaminé dont on sait qu’il n’a fait l’objet d’aucun épandage de pesticides ou d’engrais depuis ≥5 ans. Les collemboles dont on a besoin pour démarrer un élevage (v. 2.2) pourraient provenir du même endroit que ce sol témoin négatif. Avant d’utiliser un sol non contaminé prélevé sur le terrain comme sol témoin négatif dans un essai toxicologique définitif, le laboratoire d’essais doit posséder des preuves expérimentales que ledit sol permettra de satisfaire aux critères de validité de l’essai (v. 4.4).

En conséquence, le laboratoire doit exécuter des essais initiaux sur un échantillon de ce sol et avec l’espèce prévue de collembole afin de confirmer que les organismes expérimentaux peuvent satisfaire aux critères de validité applicables à l’espèce en cause (v. 3.2.1). En supposant que les résultats de ces tests biologiques initiaux sont satisfaisants, il doit ensuite analyser tous les échantillons de sol naturel choisis pour être éventuellement utilisés comme sol témoin négatif dans des essais de toxicité d’un sol (ainsi que les échantillons de sol de référence possible) par rapport aux caractéristiques physicochimiques suivantes :

On devrait aussi procéder aux analyses suivantes :

Il est recommandé de procéder aux analyses préalables suivantes pour confirmer que le sol témoin négatif ou le sol de référence ne sont pas contaminés :

Les concentrations des pesticides et des métaux ne devraient pas excéder celles établies par le CCME pour la qualité des sols, le cas échéant (v. la note de bas de page no28). Si des organismes indigènes sont présents dans l’échantillon ou les échantillons de sol naturel ou qu’ils soulèvent des problèmes (p. ex., pendant l’entreposage ou les essais), il faudrait prendre note de ce fait (fournir une description physique et indiquer leur nombre estimatif, p. ex.,) et enlever si possible ces organismes à la main (par tamisage, notamment). Si les résultats des essais biologiques initiaux et des analyses physicochimiques sont satisfaisants, on peut prélever un plus gros échantillon de ce sol naturel, le laisser sécher à l’air jusqu’à ce qu’il ait une teneur en humidité comprise entre 10 et 20 %, le tamiser avec un tamis à grosses mailles (4-10 mm), le transférer dans des seaux en plastique propres, soigneusement rincés, et l’entreposer dans l’obscurité à 4 ± 2 °C jusqu’à ce qu’on en ait besoin. On ne devrait pas utiliser de seaux en plastique pour le prélèvement et l’entreposage des échantillons de sol s’il y a un risque de lixiviation des composantes chimiques du plastique dans le sol.

3.3.2 Sol artificiel

Le sol témoin négatif peut être un sol artificiel préparé en laboratoire. L’utilisation d’un sol artificiel permet de travailler avec un matériel uniforme et normalisé; cette façon de procéder est également avantageuse dans les essais visant à mesurer la toxicité de substances chimiques dont on enrichit un sol témoin négatif (section 6).

Les méthodes publiées à l’échelle internationale concernant la préparation des sols artificiels utilisés dans divers essais de toxicité d’un sol avec des collemboles sont très semblables. L’annexe F (tableaux 4, 5 et 6) présente un résumé des critères applicables à la composition et à la préparation de sols artificiels selon les recommandations formulées dans diverses méthodes (Wiles et Krogh, 1998; ISO, 1999; OCDE, 2005); ces sols peuvent servir de sol témoin négatif dans les essais menés en laboratoire en vue de déterminer les effets d’un sol contaminé sur la survie et la reproduction de collemboles.

Conformément aux recommandations de Wiles et Krogh (1998), de l’ISO (1999), de Greenslade et Vaughan (2003), d’Environnement Canada (EC, 2004a, 2005a, 2013a) et de l’OCDE (2005)Notes de bas de page31, on devrait employer les ingrédients suivants pour préparer le sol artificiel qui sera utilisé dans la présente méthode d’essai :

Les ingrédients à l’état sec devraient être mélangés avec soin à l’aide d’un agitateur mécanique ou manuellement (porter des gants)Notes de bas de page32. On recommande d’ajouter du CaCO3 de qualité réactif au mélange sec, en quantité suffisante pour que le pH [mesuré à l’aide d’une méthode de mise en suspension dans une solution de chlorure de calcium (CaCl2); v. 4.6] du sol artificiel, une fois hydraté, se situe entre 6,0 et 7,5Notes de bas de page33. On hydrate ensuite le mélange graduellement à l’aide d’eau d’essai (eau désionisée ou distillée) jusqu’à ce que sa teneur en humidité soit de ~20 % (ce qui correspond à ~28 % de la CRE du sol), tout en continuant de mélanger jusqu’à obtention d’une couleur et d’une texture uniformes. Au besoin, on ajoutera au mélange hydraté du CaCO3 de qualité réactif en quantité suffisante pour maintenir le pH dans la plage de 6,0-7,5. Les échantillons de sol artificiel dont on a ajusté le pH devraient être entreposés dans l’obscurité, à 20 ± 2 °C, pendant ≥3 jours, avant d’être utilisés dans un essai de toxicité afin que le pH ait le temps de s’équilibrer (v. la note de bas de page no 33). Par la suite, ces échantillons peuvent être entreposés à 4 ± 2 °C. Lorsque le sol artificiel entreposé doit être utilisé dans un essai toxicologique, on recommande d’en hydrater de nouveau la quantité appropriée, à l’aide d’eau d’essai, jusqu’à obtention d’une teneur en humidité équivalant à ~70 % de la CRE.

3.4 Sol témoin positif

Il est recommandé d’inclure un ou des échantillons de sol témoin positif dans chaque série d’essais de toxicité d’un sol avec des collemboles afin de faciliter l’interprétation des résultats des essais. On s’efforcera de choisir, comme sol témoin positif, un sol toxique qui provoquera chez les organismes expérimentaux une réponse prévisible, c’est-à-dire une réponse observée dans des essais de toxicité réalisés antérieurement avec cette matière. Le sol témoin positif peut être un échantillon de sol témoin négatif enrichi avec un toxique de référence pour lequel on dispose de données historiques concernant sa toxicité pour des collemboles, mesurée dans des conditions et selon des modes opératoires précis. Aux fins de la présente méthode d’essai, on doit utiliser un ou des toxiques de référence lorsqu’on évalue la sensibilité des organismes expérimentaux ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire avec cette matière (v. 4.9). On peut également inclure dans les essais un échantillon de sol témoin négatif (naturel ou artificiel; v. 3.3) enrichi expérimentalement (section 6) avec une ou des substances chimiques toxiques préoccupantes lorsqu’on évalue l’échantillon ou les échantillons de sol d’essai, à une concentration toxique pour l’espèce de collembole utilisée conformément à la méthode d’essai biologique décrite ici. Dans certains cas, on pourrait inclure un sol témoin positif composé d’un échantillon fortement contaminé de sol ou de boues prélevé sur le terrain, qui s’est révélé systématiquement toxique pour des collemboles dans des essais réalisés selon la présente méthodeNotes de bas de page34.

3.5 Sol de référence

Un ou des échantillons de sol de référence pourraient être inclus dans un essai visant à évaluer la toxicité d’un sol pour des collemboles. Le type et la nature de l’échantillon ou des échantillons de sol utilisés comme sol de référence dans une étude donnée dépendent du schéma expérimental et des objectifs de l’étude. Si l’étude porte sur la toxicité d’échantillons de sol prélevés sur un site contaminé ou susceptible d’être contaminé, on pourrait utiliser, comme sol de référence, un ou des échantillons de sol prélevés sur un site non contaminé dont les propriétés physicochimiques (p. ex., teneur en carbone organique, TMO, granulométrie, texture, pH, conductivité) concordent le plus étroitement possible avec celles de l’échantillon ou des échantillons du sol d’essai (contaminé). Idéalement, le lieu de prélèvement du sol de référence se trouve près du ou des sites d’où proviennent les échantillons de sol d’essai, mais il est éloigné de la ou des sources de contamination. Un sol de référence non contaminé éloigné du ou des sites à l’étude pourrait également être choisi si des essais antérieurs avec des collemboles ont révélé qu’il n’est pas toxique et qu’il possède des caractéristiques physicochimiques comparables à celles du sol d’essai. Les sols de référence de la forêt boréale et de la taïga doivent être échantillonnés par horizon pédologique dans toute la mesure du possible. Chaque échantillon est ensuite entreposé et mis à l’essai individuellement (en d’autres termes, chaque horizon est traité comme un échantillon distinct). On pourrait soumettre un ou des échantillons non dilués d’un sol de référence prélevé sur le terrain à un essai de détermination de leurs effets toxiques, ou mélanger ce sol avec un ou des échantillons de sol d’essai pour préparer la gamme de concentrations à inclure dans un essai à concentrations multiplesNotes de bas de page35 (v. 3.6, 4.1 et 5.3). On ne devrait pas prélever d’échantillons de sol de référence dans des sites dont on sait qu’ils ont fait l’objet d’épandages de pesticides ou d’engrais au cours des cinq dernières années ou plus.

L’expérimentateur pourrait choisir d’inclure un ou des échantillons de sol artificiel comme sol de référence dans des essais particuliers, notamment dans des essais à concentrations multiples sur des sols de site ou des sols enrichis avec une substance chimique, afin d’étudier l’influence de certaines caractéristiques physicochimiques (p. ex., un certain nombre de sols de référence artificiels préparés pour fournir une gamme de valeurs en regard de la texture ou de la TMO; Sheppard et Evenden, 1998; Stephenson et coll., 2002) sur la toxicité d’un sol de site contaminé ou d’un sol enrichi avec une substance chimique. On pourrait aussi utiliser à cette fin des échantillons multiples de sol non contaminé prélevés sur le terrain à divers endroits, qui présentent une ou des caractéristiques physicochimiques très différentes. Dans ce cas, il est recommandé d’inclure dans l’essai une portion non diluée de chaque sol de référence utilisé pour préparer une série de concentrations du sol d’essai.

Chaque essai comportant un ou des échantillons de sol de référence doit inclure un échantillon de sol témoin négatif (v. 3.3). Par contre, pour certains essais (comportant, p. ex., une série de concentrations de sol enrichi avec une substance chimique, préparée avec un sol témoin négatif artificiel ou naturel), il n’est pas nécessaire d’inclure un échantillon de sol de référence.

Pour les essais sur un sol prélevé sur le site à l’étude, l’approche à privilégier aux fins des comparaisons consiste à inclure un ou des échantillons de sol de référence provenant d’un site voisin (v. 5.6); la décision de diluer un sol de site avec un sol de référence (plutôt qu’avec un sol témoin négatif) au cours de la préparation de la série de concentrations en vue d’un essai à concentrations multiples dépend des objectifs de l’étude.

3.6 Sol d’essai

La présente méthode d’essai biologique a été conçue pour mesurer la toxicité d’un ou de plusieurs échantillons ou mélanges de sol contaminé ou susceptible d’être contaminé (sol d’essai) avec des collemboles utilisés comme organismes expérimentaux. L’échantillon ou les échantillons de sol d’essai peuvent être constitués soit de sol prélevé sur un site industriel ou autre site préoccupant, soit de biosolides industriels ou urbains (p. ex., déblais de dragage, boues provenant d’une usine d’épuration des eaux usées urbaines, compost, fumier) dont on envisage l’épandage sur le sol.

Un échantillon de sol d’essai prélevé sur le terrain pourrait être soumis à un essai à concentration unique (c.-à-d. sans dilution aucune, généralement) ou à un essai de toxicité à concentrations multiples qu’on prépare en mélangeant des quantités mesurées de sol d’essai avec un sol témoin négatif ou un sol de référence (v. section 5)Notes de bas de page36.

Le fait de prélever des échantillons de sol par horizon permet de tenir compte de la stratification de la contamination attribuable, en partie, à la spéciation des contaminants et à leur mobilité résultante (EC, 2012). C’est pourquoi il faut prélever par horizon les échantillons de sol de référence et de sol contaminé provenant des écozones de la région boréale ou de la taïga. Les sols prélevés par horizon sont traités comme des échantillons individuels et mis à l’essai séparément (v. 4.1). L’échantillonnage des sols dont les horizons pédologiques sont indistincts (p. ex., dont les horizons superficiels ont été mélangés ou perturbés par des activités anthropiques) se fait en fonction de la profondeur (v. 5.1). Le sol d’essai pourrait aussi être constitué d’une ou de plusieurs concentrations d’un sol enrichi avec une substance chimique, qu’on prépare en laboratoire en mélangeant une ou des substances chimiques avec un sol témoin négatif, un sol de référence ou un sol de site (v. section 6).

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