Méthode d’essai biologique servant à mesurer la survie de collemboles exposés à des contaminants dans le sol : annexe E

Annexe E

Variantes des modes opératoires pour l’élevage de collemboles, telles que décrites dans les méthodes d’essai et les guides internationaux pour la mesure de la toxicité des sols à l’aide de diverses espèces de collemboles

Les documents de base sont énumérés ici dans l’ordre chronologique, selon les auteurs ou le sigle de l’organisme dont ils émanent. (Voir la section « Références » pour des détails complets.)

W & K (1998) (Wiles et Krogh, 1998) - document décrivant des protocoles de mesure des effets de substances chimiques sur la survie, la croissance et la reproduction de trois espèces de collemboles, à savoir Folsomia candida (Willem, 1902), Isotoma viridis (Bourlet, 1839) et F. fimetaria (Linné, 1758); publié en 1998 dans Handbook of Soil Invertebrate Toxicity Tests, Løkke et van Gestel (dir.), West Sussex, Angleterre.

ISO (1999) - méthode d’essai normalisée internationale pour déterminer la toxicité d’un sol à l’aide d’un essai de mesure des effets sur la reproduction de F. candida, publiée en 1999 par l’Organisation internationale de normalisation, Genève, Suisse.

OCDE (2005) - ébauche de proposition soumise par l’Institut national de recherche sur l’environnement du Danemark à l’OCDE, en vue de la publication d’une nouvelle ligne directrice pour l’évaluation des effets de sols enrichis avec une substance chimique sur la reproduction de deux espèces de collemboles (F. candida et F. fimetaria); actuellement à l’étude par l’OCDE, Paris, France.

1. Source du stock de géniteurs pour l’élevage

Document ^{Note de bas de page1}

Espèce expérimentale

Source initiale

W & K (1998)

Folsomia candida (Willem, 1902)

on peut obtenir des élevages de départ à partir de nombreux élevages de laboratoire existants

W & K (1998)

F. fimetaria (Linné, 1758)

on peut obtenir des géniteurs à partir d’échantillons de sol prélevés dans des champs, des prés ou des prairies, par extraction à la chaleur/à sec

W & K (1998)

Isotoma viridis (Bourlet, 1839)

on peut obtenir des géniteurs sur le terrain (habitats herbeux) à l’aide d’un dispositif d’aspiration par succion ^{Note de bas de page2}

ISO (1999)

F. candida (Willem, 1902)

n.i. ^{Note de bas de page3}

OCDE (2005)

F. candida (Willem, 1902) ^{Note de bas de page4}

disponible dans le commerce

OCDE (2005)

F. fimetaria (Linné, 1758) ^{Note de bas de page4}

disponible dans le commerce

2. Récipients d’élevage et capacité

Document	Type de récipient et dimensions	Capacité quant au substrat d’élevage des collemboles
W & K (1998) F. candida et I. viridis	récipient en Perspex^{Note de bas de page a} de 28 × 16 × 9 cm	1 cm de substrat d’élevage humecté avec de l’eau distillée
W & K (1998) F. fimetaria	boîtes de Petri de 90 × 13 mm	0,5 cm de substrat d’élevage
ISO (1999)	récipients en plastique du commerce de 400 mL, fermés hermétiquement	1 cm de substrat d’élevage mouillé avec de l’eau désionisée presque à saturation
OCDE (2005)	boîtes de Petri de 90 × 13 mm	0,5 cm de substrat d’élevage

3. Température et éclairage pendant l’élevage

Document	Température (ºC)	Conditions d’éclairage^{Note de bas de page b}	Humidité
W & K (1998) F. candida et I. viridis	15 ± 0,5^{Note de bas de page c}	16 h C/8 h O; <1000 lux	n.i.^{Note de bas de page d}, ^{Note de bas de page e}
W & K (1998) F. fimetaria	20 ± 1	12 h C/12 h O	n.i.
ISO (1999)	20-22	éclairage continu; 400-800 lux^{Note de bas de page f}	HR^{Note de bas de page g} : 70-80 %
OCDE (2005)	20 ± 1 ou 20 ± 0,5	12 h C/12 h O ou 16 h C/8 h O; <1000 lux^{Note de bas de page h}	n.i.

4. Substrat d’élevage

Document	Substrat d’élevage	pH	Conditions de renouvellement
W & K (1998) F. candida et I. viridis	plâtre de Paris et charbon, hydraté^{Note de bas de pageI}	n.i.^{Note de bas de pageJ}	transférer périodiquement les élevages de réserve dans du plâtre de Paris frais (p. ex., tous les 2-3 mois)
W & K (1998) F. fimetaria	plâtre de Paris et charbon, hydraté^{Note de bas de pageI}	n.i.	transférer les élevages dans des boîtes de reproduction fraîches toutes les 4-8 semaines
ISO (1999)	mélange 8/1 de plâtre de Paris et de charbon actif, hydraté^{Note de bas de pageK}, ^{Note de bas de pageL}	6,0-7,0	transférer les élevages dans des boîtes de reproduction fraîches après 8 semaines^{Note de bas de pageM}
OCDE (2005)	plâtre de Paris et charbon actif^{Note de bas de pageN}	n.i.	transférer les élevages dans des boîtes de reproduction fraîches toutes les 4-8 semaines^{Note de bas de pageO}, ^{Note de bas de pageP}

5. Alimentation pendant l’élevage

Document	Nourriture utilisée	Quantité et mode d’alimentation	Fréquence de la distribution de nourriture
W & K (1998) F. candida et I. viridis	levure sèche de boulanger^{Note de bas de pageQ}, ^{Note de bas de pageR}	10-30 mg déposés sur des disques en papier filtre	≥1-2 fois par semaine
W & K (1998) F. fimetaria	levure sèche de boulanger^{Note de bas de pageQ}	15 mg	1 fois par semaine
ISO (1999)	levure sèche granulée	petites quantités à intervalles fréquents	≥1-2 fois par semaine
OCDE (2005)	levure sèche granulée de boulanger	10-30 mg ou poids requis	1-2 fois par semaine

6. Entretien des élevages et rythme de développement

Document

Entretien des élevages synchrones

W & K (1998) F. candida

transférer plusieurs centaines de collemboles adultes des élevages de réserve dans des boîtes d’élevage fraîches, et déposer de la levure de boulanger; retirer les adultes après 24-48 h; laisser incuber les œufs à 15 ºC (ou 20 ºC, selon les besoins); observer quotidiennement et consigner la date d’éclosion; nourrir

W & K (1998) I. viridis

préparer des tubes d’éclosion (2,5 × 5 cm) contenant une couche de substrat d’élevage de 1 cm d’épaisseur; transférer des grappes d’œufs des élevages de réserve dans les tubes à l’aide d’un pinceau fin humecté; laisser incuber les œufs à 15 ºC (ou 20 ºC, selon les besoins); observer quotidiennement; passer un pinceau trempé dans l’eau distillée sur les œufs présentant une contamination fongique; transférer les collemboles qui viennent d’éclore dans un bocal à couvercle vissé (capacité de 120 mL) contenant 1 cm d’épaisseur de substrat d’élevage; nourrir

F. fimetaria

transférer 150-300 adultes d’un substrat vieux de 4-8 semaines dans des boîtes d’élevage fraîches et nourrir; au bout de 9 jours, prélever délicatement des œufs à l’aide d’une aiguille et d’une spatule et les déposer sur un papier d’éclosion (petit morceau de papier filtre trempé dans du substrat d’élevage); placer le papier d’éclosion dans une boîte d’élevage fraîche et maintenir l’humidité; la plupart des œufs écloront au bout de 3 jours; retirer le papier à éclosion de la boîte de Petri pour obtenir des élevages synchrones; nourrir

ISO (1999)

éviter le surpeuplement ^{Note de bas de page5} ; à l’aide d’une fine spatule ou d’un pinceau fin, transférer les grappes d’œufs ^{Note de bas de page6} des boîtes d’élevage sur un substrat d’élevage fraîchement préparé; au bout de 48 h, retirer les grappes d’œufs et nourrir les larves qui ont émergé des œufs ^{Note de bas de page7}

OCDE (2005) F. candida

transférer plusieurs centaines d’adultes des élevages de réserve dans des boîtes d’élevage fraîches contenant une couche de substrat de 1 cm d’épaisseur et déposer de la levure de boulanger; retirer les adultes au bout de 24-48 h; observer quotidiennement et consigner la date d’éclosion; nourrir

OCDE (2005) F. fimetaria

transférer de 150-300 adultes d’un substrat vieux de 4-8 semaines dans des boîtes d’élevage fraîches contenant une couche de substrat d’élevage de 0,5 cm d’épaisseur et nourrir avec 15 mg de levure de boulanger; au bout de 9 jours, prélever délicatement des œufs à l’aide d’une aiguille et d’une spatule et les déposer sur un papier d’éclosion (petit morceau de papier filtre trempé dans du substrat d’élevage); placer le papier d’éclosion dans une boîte d’élevage fraîche et maintenir l’humidité; la plupart des œufs écloront au bout de 3 jours; retirer le papier à éclosion de la boîte de Petri pour obtenir des élevages synchrones; nourrir

7. Indices de santé et d’acceptabilité des élevages; âge des collemboles utilisés dans les essais de toxicité; transfert des organismes dans les récipients d’essai

Document	Indices de santé et d’acceptabilité des élevages	Âge des collemboles utilisés dans les essais de toxicité	Transfert des collemboles dans les récipients d’essai
W & K (1998) F. candida	n.i.^{Note de bas de pageS}	juvéniles âgés de 10-12 jours	aspirateur à air portable
W & K (1998) I. viridis	n.i.	juvéniles âgés de 5-7 jours
W & K (1998) F. fimetaria	n.i.	organismes âgés de 23-26 jours
ISO (1999)	n.i.	juvéniles âgés de 10-12 jours	en tapotant le récipient ou à l’aide d’un exhausteur^{Note de bas de pageT}
OCDE (2005)	n.i.	adultes	appareil d’aspiration à flux d’air à faible succion

Note de bas de page

Notes de bas de page 1

Voir la section « Références » pour des détails complets.

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Notes de bas de page 2

Les mois d’avril-mai et de septembre-octobre constituent les meilleurs moments de l’année pour prélever les organismes dans les régions au climat tempéré.

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Notes de bas de page 3

n.i. = non indiqué..

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Notes de bas de page 4

D’autres espèces de collemboles peuvent également convenir, p. ex., I. viridis ou O. folsomi. Si d’autres espèces sont utilisées, il faut les identifier clairement et indiquer les raisons pour lesquelles elles ont été choisies.

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Notes de bas de page A

Les stocks de géniteurs plus importants peuvent être conservés dans de grands récipients alimentaires en plastique (30 × 30 × 20 cm); nota : certains types de matière plastique peuvent libérer des composés organiques toxiques qui pourraient avoir une incidence sur l’élevage et l’essai.

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Notes de bas de page B

C = clarté; O = obscurité.

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Notes de bas de page C

Peuvent être gardés à 20 ºC, au besoin.

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Notes de bas de page D

n.i. = non indiqué.

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Notes de bas de page E

Les élevages doivent être gardés humides en tout temps; toutefois, pour I. viridis, il est préférable d’éviter la formation d’une couche d’humidité à la surface du plâtre de Paris, car la présence d’une telle couche d’humidité a tendance à accroître le taux de mortalité des collemboles qui viennent d’éclore.

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Notes de bas de page F

Un cycle de 16 h de clarté et de 8 h d’obscurité convient également.

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Notes de bas de page G

HR = humidité relative.

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Notes de bas de page H

Les récipients sont gardés humides en tout temps.

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Notes de bas de page I

Ajouter 260-300 mL d’eau à 450 g du mélange de plâtre et de charbon.

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Notes de bas de page J

n.i. = non indiqué.

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Notes de bas de page K

On peut aussi utiliser des rapports plus élevés (9/1 ou 10/1) entre les quantités de plâtre et de charbon.

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Notes de bas de page L

Ajouter de 60-100 g d’eau à 100 g du mélange de plâtre et de charbon; toutefois, la quantité d’eau ajoutée dépend du type de plâtre. La présence d’eau à la surface du substrat saturé est essentielle pour que les collemboles se reproduisent.

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Notes de bas de page M

Transférer les collemboles en tapotant le récipient ou en soufflant sur les collemboles pour qu’ils tombent sur le substrat frais.

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Notes de bas de page N

20 mL de charbon actif, 200 g de plâtre de Paris et 200 mL d’eau distillée ou 50 g de charbon pulvérisé actif, 400 g de plâtre de Paris et 260-300 mL d’eau distillée.

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Notes de bas de page O

Élevages de réserve transférés périodiquement (p. ex., tous les 2-3 mois) dans du plâtre de Paris frais.

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Notes de bas de page P

Retirer les organismes morts et la nourriture délaissée du récipient.

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Notes de bas de page Q

Autres aliments proposés : algues vertes (Pleurococcus spp.), flocons Tetramin® pour poissons, carottes râpées mélangées à des flocons d’avoine, flocons alimentaires pour drosophiles et morceaux de pomme de terre.

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Notes de bas de page R

Pour I. viridis, on peut déposer une petite quantité de sol prélevé sur le terrain et débarrassé de sa faune (5 g de sol tamisé et chauffé à 70 ºC), à l’une des extrémités du récipient.

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Notes de bas de page 5

Le surpeuplement peut ralentir la croissance et, partant, les organismes âgés de 10-12 jours utilisés dans l’essai risquent d’être trop petits et pas encore capables de produire un nombre suffisant d’oeufs pour satisfaire aux exigences de l’essai.

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Notes de bas de page 6

L’extraction des grappes d’oeufs est facilitée si celles-ci sont placées sur de petites portions de substrat d’élevage ou si des lamelles couvre-objet sont posées sur le substrat d’élevage.

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Notes de bas de page 7

Une autre méthode pour obtenir des organismes expérimentaux du même âge (élevages synchrones) consiste à déposer un certain nombre de collemboles adultes dans un petit récipient contenant du plâtre de Paris et à les laisser pondre pendant deux jours. On retire ensuite les adultes et on utilise les juvéniles 12 jours après l’éclosion. Il est conseillé de vérifier si des oeufs ont été pondus avant de retirer les adultes car, dans certains cas, la ponte ne commence pas immédiatement. Si le nombre d’oeufs produits au bout de 2 jours est insuffisant, on garde les adultes dans les récipients pendant un ou plusieurs jours supplémentaires.

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Notes de bas de page S

n.i. = non indiqué

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Notes de bas de page T

Les collemboles sont aspirés individuellement à l’aide d’une pointe de pipette pour être transférés dans un petit récipient muni d’un couvercle. Il faut veiller à ce que la succion de la poire d’aspiration soit faible pour ne pas blesser les organismes. Une fois le couvercle retiré, les collemboles destinés à un récipient d’essai sont transférés sur la surface du substrat dans l’enceinte expérimentale. On peut également utiliser un exhausteur manuel.

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