Information sur les aliments nouveaux - Lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides

Santé Canada a informé Pioneer Hi-Bred Production Ltd. qu'il ne s'oppose pas à l'utilisation alimentaire des lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides. Le Ministère a réalisé une évaluation approfondie de ces variétés, soit un examen conforme à ses Lignes directrices relatives à l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux. Ces lignes directrices sont fondées sur les principes admis internationalement de l'établissement de l'innocuité d'aliments comportant des caractères nouveaux.

Contexte

Le texte qui suit résume l'avis remis par Pioneer Hi-Bred Production Ltd. à Santé Canada ainsi que l'évaluation du Ministère. Il ne contient aucun renseignement commercial confidentiel.

1. Introduction

Pioneer Hi-Bred Production Ltd. a mis au point deux lignées de canola (Brassica napus L.) tolérant les herbicides et contenant les événements DP-Æ73496-4 et DP-Æ61Æ61-7, c'est-à-dire 73496 et 61061, respectivement. Ces lignées ont été mises au point au moyen d'un bombardement de microprojectiles de microspores embryonnaires avec un fragment d'ADN de 2,1 kb (c.-à-d. PHP28181A). Ce fragment contient la séquence codante ainsi que les éléments régulateurs requis pour l'expression de la protéine GAT4621, un glyphosate acétyltransférase (GAT) issu du génie génétique capable de convertir le glyphosate en une forme non phytotoxique, le N-acétyl glyphosate. La protéine GAT4621 a déjà fait l'objet d'une évaluation par Santé Canada dans le cadre de l'étude de la lignée de maïs 98140 de Pioneer Hi-Bred Production Ltd.

Cette évaluation de l'innocuité, dont les scientifiques de la Direction des aliments se sont chargés, a été réalisée conformément aux Lignes directrices relatives à l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux de Santé Canada. Ces dernières sont fondées sur les démarches visant l'harmonisation avec les directives établies par d'autres autorités réglementaires et reflètent les documents d'orientation internationaux dans ce domaine (p. ex., du Codex Alimentarius). L'évaluation en question a porté sur les aspects suivants : la façon dont les lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides ont été mises au point, la comparaison entre la composition et la qualité nutritionnelles de ces deux lignées et celles des variétés traditionnelles et, enfin, leur toxicité et leur allergénicité éventuelles. Pioneer Hi-Bred Production Ltd. a produit des données démontrant que les lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides sont tout aussi sûres que les variétés de canola traditionnelles utilisées dans les aliments au Canada et que leur qualité nutritionnelle est la même.

La Direction des aliments assume la responsabilité de l'évaluation préalable à la mise en marché des aliments nouveaux et des ingrédients alimentaires nouveaux. La responsabilité en question, imposée par la loi, est exposée en détail au titre 28 du Règlement sur les aliments et drogues. Les lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides sont considérées comme des aliments nouveaux en vertu de la partie suivante de leur définition :

« c) aliment dérivé d'un végétal, d'un animal ou d'un micro-organisme qui, ayant été modifié génétiquement, selon le cas :

1. présente des caractères qui n'avaient pas été observés auparavant, [...]. »

2. Mise au point de la plante modifiée

Le requérant a produit la description des méthodes appliquées à la mise au point des lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides ainsi que les données en matière de biologie moléculaire caractérisant la modification génétique entraînant la tolérance accrue aux produits herbicides à base de glyphosate. Ce phénotype a été obtenu au moyen du bombardement par des microprojectiles de la variété 1822B de canola traditionnel avec un fragment d'ADN de 2,1 kb (c.-à-d. PHP28181A) contenant la séquence codante et les éléments régulateurs permettant l'expression de la protéine GAT4621. Des microspores embryonnaires de la variété 1822B ont été bombardées avec des particules d'or enduites du fragment d'ADN PHP28181A. Les transformants efficaces ont été sélectionnés en fonction de leur tolérance au glyphosate. Des plantes issues de la transformation et de la culture tissulaire ont été retenues en vue d'une mise au point plus poussée reposant sur des analyses moléculaires, l'efficacité des herbicides et les évaluations agronomiques. De celles-ci, deux lignées (73496 et 61061) ont été sélectionnées.

3. Caractérisation des plantes modifiées

Une analyse par transfert de Southern des lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides a révélé l'insertion d'une seule copie de la séquence codante gat4621 et de ses éléments régulateurs requis à un seul locus de chaque lignée. L'analyse a aussi porté sur l'absence de toute séquence étrangère apparentée au plasmide dont le fragment d'ADN PHP28181A a été dérivé.

La stabilité de l'hérédité de l'insert a été déterminée sur plusieurs générations des deux lignées de canola (73496 et 61061). L'ADN de cinq générations de chacune des lignées a été analysé par transfert de Southern, et la présence de l'insert unique a été confirmée dans chaque génération de chacune des lignées. L'analyse du mode de transmission génétique du gène gat4621 (c.-à-d. la séquence codante et les éléments régulateurs) et le phénotype de tolérance à l'herbicide dans plusieurs générations en ségrégation des lignées de canola 73496 et 61061 se sont révélés cohérents avec la conclusion selon laquelle un seul site d'insertion se transmet conformément aux lois de la génétique mendélienne.

4. Information sur le produit

Les lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides se distinguent de leur pendant traditionnel par la présence de la séquence codante gat4621 et de ses éléments régulateurs requis. L'insertion du gène gat4621 produit l'expression de la protéine GAT4621 : un glyphosate acétyltransférase (GAT) issu du génie génétique capable de convertir le glyphosate en une forme non phytotoxique, le N-acétyl glyphosate. Les plants de canola exprimant la protéine GAT4621 sont donc tolérants à l'herbicide glyphosate.

La séquence codante de la protéine GAT4621 (c.-à-d. gat4621) est un dérivé de trois gènes gat naturels de la bactérie Bacillus licheniformis dont la présenceest courante dans le sol. La séquence codante gat4621 a été produite au moyen de 11 cycles de réarrangement des gènes : il s'agit d'une technique génétique qui facilite la combinaison de portions du gène dans le but de produire des formes chimères dotées de propriétés uniques. B. licheniformis est répandu dans les aliments et l'eau. À cause de son utilisation de longue date apparemment sans danger qui n'a suscité aucune préoccupation sur le plan de l'innocuité dans la production alimentaire, l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) (2009) a ajouté B. licheniformis à la liste QPS (Présomption d'innocuité reconnue) des organismes sources pouvant être utilisés sans danger dans les aliments destinés à la consommation humaine et animale. Qui plus est, diverses souches de B. licheniformis sont approuvées à titre d'organismes sources d'enzymes destinées aux aliments (p. ex., l'amylase, la protéase et la pullulanase) conformément au Règlement sur les aliments et drogues et les Autorisations de mise en marché (AM) d'additifs alimentaires qui lui sont associé (Liste des enzymes alimentaires autorisées). Par conséquent, il est peu probable que le recours à B. licheniformis,comme organisme source des gènes gat, se révèle préoccupant, que ce soit sur le plan de la pathogenèse, de la toxicité ou de l'allergénicité.

Le requérant a produit des données démontrant le degré d'expression de la protéine GAT4621 dans les lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides. L'étude dont elles sont issues a porté sur des échantillons de plantes cultivées dans six sites d'essais au champ au Canada et aux États-Unis pendant la saison de croissance des cultures de 2009. Tous les champs étaient situés dans des régions convenant à la culture du canola tout en représentant un éventail de conditions environnementales présentes dans le cadre de la production de la plante. Dans chaque site, les lignées de canola transgénique (73496 et 61061) et une lignée de canola isogénique ont été plantées selon un plan en blocs aléatoires. Pour quantifier la protéine GAT4621, les tissus recueillis des lignées ont été les suivants : la graine, les racines et la plante entière. Les échantillons de tissus ont été prélevés de chacun des blocs, et ce, de manière impartiale et parmi des plantes saines aux stades suivants de leur croissance : BBCH 15 - cinq feuilles étalées (plantes entières); BBCH 33 - trois entre-nœuds formés (plantes entières); BBCH 65 - pleine floraison, 50 % des fleurs sur la même grappe ouvertes, quelques pétales tombés (plantes entières et racines) et BBCH 90 - sénescence (graines). De plus, la concentration en protéine GAT4621 a été quantifiée dans des échantillons de glumes et de tourteaux grillés produits à partir d'échantillons de graines en mélange récoltées des lignées de canola (73496 et 61061) de plein champ.

La concentration en protéine GAT4621 a été établie en recourant au test ELISA. La concentration en protéine des tissus a été calculée en microgrammes (µg) par gramme (g) de poids sec (p. s.). L'expression de la protéine GAT4621 est maîtrisée par le promoteur constitutif du gène de la polyubiquitine UBQ10 d'Arabidopsis thaliana. Des teneurs quantifiables en protéine GAT4621 ont été détectées dans les tissus végétaux analysés des deux lignées de canola transgénique. La fourchette des concentrations moyennes dans les échantillons de plantes entières à l'échelle des stades de croissance s'étendait de 5,2 à 6,9 µg/g p. s. dans la lignée de canola 734896 et de 7,9 à 12 µg/g p. s. dans la lignée de canola 61061. Les concentrations moyennes en protéine GAT4621 mesurées dans les échantillons de graines se sont révélées semblables, soit de 6,2 et de 5,1 µg/g p. s. pour les lignées de canola 73496 et 61061, respectivement.

La concentration en protéine GAT4621 des produits transformés dérivés de graines des lignées de canola 73496 et 61061 a aussi été analysée. Des teneurs quantifiables en protéine GAT4621 ont été mesurées dans toutes les fractions transformées analysées, notamment dans la glume des graines, le tourteau grillé transforméde graines déglumées et le tourteau grillé de graines non déglumées. La concentration en protéine GAT4621 du tourteau grillé de graines déglumées (8,1 et 3,0 µg/g p. s. dans les lignées de canola 73496 et 61061, respectivement) s'est révélée plus élevée que la valeur correspondante relative au tourteau grillé de graines non déglumées (2,5 et 2,2 µg/g p. s. dans les lignées de canola 73496 et 61061, respectivement), et cela, plus particulièrement dans les produits dérivés de la lignée 73496. Selon le requérant, il est possible que différents processus de toastage aient été appliqués au tourteau de graines déglumées et à celui de graines non déglumées et/ou que l'écart ait été causé par le traitement en petits lots, ce qui a pu se répercuter sur l'ampleur de la dénaturation de la protéine et, par conséquent, sur la possibilité qu'elle soit détectée au moyen du test Elisa. Selon les évaluateurs, cette justification est acceptable pour expliquer les différences sur ce plan.

5. Exposition alimentaire

Les lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides devraient être utilisées dans les mêmes produits et des mêmes façons que le sont les variétés traditionnelles de canola. La seule fraction de canola consommée par les humains est l'huile raffinée, décolorée et désodorisée (RDD). L'expression de la protéine GAT4621 a entraîné l'augmentation de la concentration en acides aminés N-acétylés (principalement les N-acétylaspartate et N-acétylglutamate) du tissu de la graine des lignées de canola 73496 et 61061. Le requérant a aussi indiqué que des acides aminés acétylés sont naturellement présents dans le canola, mais qu'ils le sont aussi dans d'autres aliments de consommation courante (p. ex., les œufs, le dindon et le bœuf), ce qui démontre leur innocuité. Qui plus est, il est peu probable que ces teneurs accrues en acides aminés acétylés soient observées dans le seul produit à base de canola destiné à la consommation humaine (c.-à-d. l'huile RDD) puisque les acides aminés en sont éliminés pendant le processus de fabrication jusqu'à atteindre un seuil de non-détection. Le requérant a indiqué que le lancement des lignées de canola 73496 et 61061 ne devrait pas avoir d'incidence importante sur l'usage alimentaire de l'huile de canola RDD.

6. Nutrition

La composition nutritionnelle des lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides a été évaluée au moyen de données produites dans le cadre d'essais au champ menés dans six sites représentatifs des principales régions productrices de canola au Canada et aux États-Unis pendant la saison de croissance des cultures de 2009. Les lignées de canola transgénique (73496 et 61061) ont été cultivées avec la lignée témoin (une lignée quasi isogénique ne codant pas pour le gène gat4621) conformément à un plan en quatre blocs aléatoires par site. Alors que les lots consacrés aux lignées de canola 73496 et 61061 ont été traités au glyphosate, les autres n'ont reçu aucun traitement. Des échantillons de graines de toutes les lignées ont été recueillis et analysés afin d'en déterminer la teneur en chacun des principaux constituants nutritionnels. Conformément au Consensus Document on Key Nutrients and Key Toxicants in Low Erucic Acid Rapeseed (Canola), publié par l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE), les macronutriments, les fibres, les acides gras, les acides aminés, les vitamines, les minéraux, les glucosinolates, les métabolites secondaires, les phytostérols et les facteurs antinutrionnels ont fait l'objet d'une analyse, ce qui a donné lieu à l'évaluation d'environ 100 analytes. Pour produire les analyses statistiques, soit les moyennes, les intervalles de confiance et les comparaisons statistiques, le logiciel SAS (version 9.2) a été utilisé. Des intervalles de tolérance ont aussi été utilisés dans le but d'évaluer la pertinence nutritionnelle des différences statistiquement significatives entre la lignée de canola témoin et les lignées de canola 73496 et 61061. Ces intervalles ont été élaborés en recourant aux données issues d'études antérieures, notamment ayant porté sur des lignées de canola traditionnel commercial cultivées et transformées dans des conditions semblables.

Les analytes issus de la lignée de canola 73496 qui se sont révélés statistiquement différents de ceux de la lignée témoin, soit présentant une différence supérieure à 10 % entre leurs valeurs moyennes, étaient les suivants : la vitamine B2 et le delta-tocophérol; les glucosinolates, par exemple la progoitine, la glucoalyssine et la néoglucobrassicine; les métabolites secondaires, les tanins insolubles et le cholestérol.

Les analytes issus de la lignée de canola 61061 qui se sont révélés statistiquement différents de ceux de la lignée témoin, soit présentant une différence supérieure à 10 % entre leurs valeurs moyennes, étaient les suivants : le magnésium, le delta-tocophérol; les glucosinolates, par exemple la progoitine, la glucobrassicine, la glucoalyssine et la néoglucobrassicine; les métabolites secondaires, les tanins insolubles et le cholestérol.

Pour les raisons suivantes, les différences relevées entre la lignée de canola témoin et les lignées de canola transgénique ne suscitent aucune préoccupation en matière d'innocuité nutritionnelle : les différences entre la lignée de canola témoin et les lignées de canola transgénique ont été observées sur le plan de leur teneur en certains glucosinolates, par exemple la progoitrine, la glucobrassicine, la glucoalyssine et/ou la néoglucobrassicine. Toutefois, les concentrations moyennes en glucosinolates totaux ne se sont pas révélées statistiquement différentes entre la lignée de canola témoin et les lignées de canola transgénique; en règle générale, les tanins sont mis en cause à l'égard d'effets antinutritionnels, car avec les protéines, ils forment des complexes solubles et insolubles, mais de plus faibles teneurs en tanin ne suscitent aucune préoccupation sur le plan nutritionnel; l'éventail des valeurs issues de tous les analytes demeure dans les intervalles de tolérance établis pour les lignées commerciales de canola traditionnel, et plusieurs nutriments sont éliminés au cours du processus de fabrication de l'huile RDD, le principal aliment fabriqué à partir du canola. Enfin, la vitamine B, les minéraux et les glucosinolates ne comptent pas parmi les principaux constituants de l'huile de canola.

7. Chimie et toxicologie

Afin de produire suffisamment de protéine GAT4621 pour réaliser les études de toxicité et d'allergénicité, un système d'expression d'Escherichia coli a été utilisé. Les données présentées par le requérant ont suffi à démontrer que la protéine GAT4621 produite par E. coli équivaut sur les plans biochimique, structurel et fonctionnel à la protéine GAT4621 générée par les lignées de canola 73496 et 61061. Par conséquent, les résultats issus des études portant sur la protéine GAT4621 d'origine microbienne peuvent être extrapolés à la protéine GAT4621 d'origine végétale présente dans les lignées de canola 73496 et 61061. Les poids moléculaires de la protéine, leur immunoréactivité, les séquences de l'aminoacide du N-terminal et leur empreinte de masse peptidique tryptique ont été les fondements de la démonstration de l'équivalence.

Une étude de toxicité aiguë de 14 jours a été menée chez des souris. Cinq mâles et cinq femelles Crl:CDÒ-1(ICR)BR ont reçu soit 1 640 mg de la préparation de protéine GAT4621 issue de la production microbienne (d'une pureté de 95 %/kg p. c.), soit 1 640 mg d'albumine sérique bovine/kg p. c., soit un vecteur témoin (de l'eau désionisée), par gavage pendant 14 jours. Les souris ont été pesées aux jours 0, 1, 2, 7 et 14 après le traitement. Aucun effet indésirable ni changement de poids ou de consommation alimentaire n'ont été observés chez les animaux expérimentaux par rapport aux témoins ayant ingéré la protéine et le vecteur témoin. Un examen macroscopique réalisé à l'autopsie n'a révélé aucune modification découlant du traitement. Une dose sans effet observé (DSEO) de 1 640 mg/kg p. c./jour a été établie en se fondant sur la dose la plus élevée ayant été mise à l'essai.

Des recherches bio-informatiques au moyen de l'algorithme BLASTP 2.2.13 à partir de la base de données Entrez (10 530 540 séquences) du National Center for Biotechnology Information (NCBI, 2010) ont été lancées en utilisant la séquence protéique de la protéine GAT4621. Celles-ci n'ont révélé aucune similitude structurelle pertinente entre la protéine GAT4621 et une quelconque protéine dont l'innocuité toxicologique suscite des préoccupations.

8. Allergénicité

La séquence d'acides aminés de la protéine GAT4621 a été comparée aux séquences obtenues de l'Allergen Database (version 10.0, 2010) du Food Allergy Research and Resource Program (FARRP) au moyen de l'outil d'alignement de séquence FASTA34 (Pearson et Lipman, 1988). Aucune des 1 471 séquences ainsi obtenues n'affichait un taux d'identité des acides aminés égal ou supérieur à 35 % avec la protéine GAT4621. De plus, une recherche a été réalisée en recourant à une fenêtre glissante de 8 acides aminés pour rechercher d'éventuels épitopes de liaison des IgE linéaires. Aucune identité de séquence de la protéine GAT4621 avec une quelconque séquence d'allergènes connue ou présumée d'au moins 8 acides aminés contigus n'a été révélée. Cela a permis de déduire que la protéine GAT4621 n'a aucune identité de séquence d'importance avec les allergènes connus.

Selon des tests ELISA, les concentrations moyennes en protéine GAT4621 d'extraits de graines de canola traité à l'herbicide provenant des lignées 73496 et 61061 ont été établies à 6,2 et 5,1 µg/g p. s., respectivement. Les données présentées sur la composition en nutriments des graines des lignées de canola 73496 et 61061 indiquent que les protéines comptent pour 25,9 et 25,8 % du poids sec de ces graines, respectivement. Ainsi, la protéine GAT4621 ne constitue que 2,0 à 2,4 10-3 % des protéines totales contenues dans les graines des lignées de canola transgénique. Normalement, les protéines allergènes exercent une fonction de réserve et constituent de 1 à 80 % des protéines totales. Par conséquent, comme la protéine GAT4621 n'est présente qu'en quantité négligeable dans les graines des lignées de canola 73496 et 61061, il est peu probable qu'elle agisse comme un allergène.

La protéine GAT4621 d'origine microbienne a été digérée dans un liquide gastrique et dans un liquide intestinal simulés pendant 30 secondes et 5 minutes, respectivement. Puisque la plus grande part de la protéine GAT4621 devrait vraisemblablement être digérée dans l'estomac, il est peu probable que, fonctionnellement active, la protéine en question issue de l'apport alimentaire comporte un risque pour la santé humaine.

Le requérant a démontré, en se fondant sur une analyse en continu par spectrophotométrie d'absorption, que la protéine GAT4621 d'origine microbienne perd 50 % de son activité fonctionnelle lorsqu'elle est exposée à une température atteignant de 49 à 52 °C pendant 15 minutes et qu'à compter de 53 °C, elle se trouve essentiellement inactivée.

Le requérant a indiqué que l'huile de graines de canola RDD des lignées 73496 et 61061 sera le seul produit issu de celles-ci à être destiné à la consommation humaine. Comme cette huile ainsi traitée ne contient qu'une quantité négligeable de protéines (Fichier canadien sur les éléments nutritifs) et que la protéine y subsistant est dénaturée pendant le processus de fabrication (c.-à-d. pendant le processus de cuisson des graines à plus de 80 °C), il est peu probable que les huiles de canola RDD constitueront pour les consommateurs canadiens une importante source d'exposition à la protéine GAT4621 ou à quelque autre protéine de la graine de canola.

Conclusion

L'examen qu'a réalisé Santé Canada de l'information présentée à l'appui de l'utilisation alimentaire des lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides ne suscite pas de préoccupations sur le plan de l'innocuité. De l'avis de Santé Canada, les aliments dérivés de ces lignées de canola ne comportent pas davantage de danger et sont tout aussi nutritifs que les variétés de canola actuellement sur le marché.

L'opinion formulée par Santé Canada n'a trait qu'à l'utilisation alimentaire des lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides. Les questions relatives à leur utilisation dans l'alimentation animale ont été étudiées séparément conformément aux processus réglementaires mis en œuvre par l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA). L'ACIA a évalué l'information communiquée sur l'innocuité des lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides pour la santé environnementale, animale et humaine dans la perspective de son utilisation dans l'alimentation animale. L'ACIA a conclu qu'elle ne suscitait pas de préoccupations en matière d'innocuité, que ce soit sur le plan de l'environnement ou de l'alimentation animale. Ce point de vue est valable pour les produits alimentaires dérivés des lignées de canola 73496 et 61061 tolérant les herbicides destinés à la vente à des fins de consommation humaine et animale.

Il incombe au fabricant ou à l'importateur de veiller en permanence à ce que leur produit soit conforme à toutes les exigences légales et réglementaires. Dans le but de veiller à l'innocuité et à l'intégrité de tous les aliments offerts sur le marché canadien, tout renseignement inédit relatif à ces produits indiquant une incidence éventuelle sur la santé et la sécurité doit être communiqué à Santé Canada aux fins d'un examen. La vente d'un aliment qui comporte un risque pour la santé des consommateurs enfreindrait les dispositions de la Loi sur les aliments et drogues.

Le présent document sur les aliments nouveaux résume l'avis sur le produit visé par la Direction des aliments, Direction générale des produits de santé et des aliments, Santé Canada. Cet avis est fondé sur l'analyse détaillée des renseignements fournis par le requérant, conformément aux Lignes directrices relatives à l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux.

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